Информация о лаборатории
Молодым исследователям


Сотрудники

Главная        Контакты       


История

Истоки лаборатории клеточной нейробиологии уходят в лето 1961 г., когда в Москву приехал с лекциями лауреат Нобелевской премии, профессор Бернард Катц. В МГУ лекцию Катца синхронно переводил Борис Вепринцев, молодой сотрудник кафедры биофизики биологического факультета, недавно защитивший кандидатскую диссертацию. После лекции разгорелась жаркая дискуссия, поскольку руководство кафедры не признавало мембранной теории возбуждения, одним из основоположников которой был Б. Катц. Большинство физиологов страны придерживались так называемой «теории Насонова-Александрова», объясняющей передачу возбуждения диффузией ионов в протоплазме. Вепринцев активно вступился за мембранную теорию и Катца. Дискуссия достигла такого накала, что после нее Борис уже не мог (и/или не хотел) оставаться на кафедре. По приглашению Льва Петровича Каюшина (тогдашнего заместителя Директора по науке) он перешел в Институт биологической физики АН СССР (ИБФ АН СССР) в огромную лабораторию биофизики живых структур, которую возглавлял директор Института академик АН СССР Глеб Михайлович Франк. А с Катцем у Вепринцева установились очень теплые отношения, которые имели для лаборатории важные положительные последствия: публикация статей в Nature и J. Physiology (London), стажировка П.Д. Брежестовского в Лондонском Университетском колледже. Б.Н. Вепринцеву в ИБФ АН СССР на ул. Профсоюзной была отведена маленькая узкая комната (очень неудобная для экспериментальной работы) и выделена лаборантка Мила Кулида, в 1964 г. поступившая в МГУ. Кроме того, в группе работал студент-курсовик МФТИ, потом дипломник, Лев Ермишкин, в мае 1962 г. в аспирантуру поступила Екатерина Вульфиус. Осенью того же года в связи с готовившимся перебазированием Института в Пущино в качестве «пущинских стажеров» были приняты выпускники МГУ. Так состав группы пополнился Таисией Хаустовой (Дьяконовой) и Станиславом Гуриным. В 1963 г. в аспирантуру поступил Сергей Розанов. Короткое время помаячил дипломник из Ростовского государственного Университета Евгений Фесенко, который вскоре перешел в лабораторию Ю.А. Владимирова.

Летом-осенью 1964 г. начался переезд в Пущино. К сожалению, к этому времени ушел к Е.А. Либерману тогда уже аспирант Лев Ермишкин. Состав группы увеличился: в аспирантуру поступил выпускник кафедры биофизики МГУ Альберт Кислов, из Москвы переехала замечательная старшая лаборантка, заботливая хозяйка и «всеобщая мама» Сария Мамедовна Гасанова, Борис Николаевич пригласил из Риги Игоря Крастса – своего спутника по экспедициям в качестве инженера. К ноябрю 1964 г. вся группа переместилась в Пущино. Работали в здании вивария, на втором этаже в большой комнате размещались 3 группы: группа С.Э. Шноля, С.М. Женодаровой и наша. Потом получили комнату в подвале, а в январе 1965 г. переехали в главное здание, где температура в комнатах редко бывала выше 11оС. Отапливались «козлами», уплотнителями для асбоцементных труб (это тоже асбоцементная труба диаметром около 20 см и толщиной стенок 2-3 см, тяжеленная) на ножках из стального прута с продетой через отверстия трубы самодельно намотанной очень мощной спиралью (ток – страшно подумать – измерялся несколькими амперами). Всю осень и зиму И.В. Крастс, А.Н. Кислов и Е.А. Вульфиус монтировали из подручных средств первую микроэлектродную установку – для Екатерины Анатольевны Вульфиус.

Постепенно группа росла: в 1965 г. поступила в аспирантуру Эдит Гахова, после четырех-пятимесячной работы за так была принята младшим научным сотрудником Ольга Юрченко, бывшая дипломница С.И. Розанова (1967 г.), из расформированной лаборатории пришла Ольга Жерелова (около 1968 г.), потом дипломник (в дальнейшем аспирант) Петр Брежестовский (1969 г.), Лариса Бочарова (1969 г.), аспиранты Марина Костенко и Виталий Гелетюк (1970 г.), Валентина Мусиенко, стажер-исследователь Николай Чемерис (1970 г.). В начале 70-х годов был хороший контакт с кафедрой бионики физфака Казанского государственного Университета: оттуда приехали дипломниками Владимир Казаченко, Виктор Ильин, Надежда Приходько; двое первых остались в лаборатории. Примерно в это же время группа обогатилась хорошими инженерами – сначала Борисом Санталовым и Василием Вершининым, потом Борисом Успенским. В группу культуры нервных клеток поступили аспиранты Владимир Архипов и Надежда Третьяк, туда же перешла Валентина Мусиенко и из другой лаборатории Татьяна Смолихина.

В 1976 г. группа получила статус лаборатории и имя: лаборатория явлений возбуждения. В конце 70х годов в связи с изменением научных интересов Бориса Николаевича в лабораторию пришли несколько новых аспирантов и сотрудников: Людмила Межевикина, Наиля Чекурова, Татьяна Свиридова, Виктор Утешев, Михаил Зубин и другие, но настоящего контакта с ними так и не сложилось, старое «ядро лаборатории» воспринимало их как чужеродное тело. Позже лаборатория разделилась на две лаборатории: в одну, лабораторию консервации генетических ресурсов под руководством Б.Н. Вепринцева, из «старых» сотрудников вошли Э.Н. Гахова и А.Н. Кислов; другая по-прежнему занималась исследованием ионных каналов и рецепторов медиаторов, руководители менялись: В.И. Ильин, Н.К. Чемерис, В.Н. Казаченко. В разное время в лаборатории, которая изменила название на лабораторию биофизики нервной клетки (потом лабораторию клеточной нейробиологии) работали Абрам Акопян, Тимофеев, Олег Асланиди, Алла Аловская, Аида Габдулхакова, Анна Миллер, Владимир Рязанский, Наталья Кабанова, Ольга Тумина, Надежда Авхачева, Валентина Мальцева. В настоящее время заведующим лабораторией является В.Г. Сафронова.

Наука

Тема кандидатской диссертации Б.Н. Вепринцева (1960 г.) была посвящена температурной зависимости возбуждения в гигантском аксоне дождевого червя с целью выяснения, принимают ли биохимические реакции участие в генерации потенциала действия и распространении сигнала по волокну. Это направление было продолжено В.Ф Антоновым в МГУ и Л.Н. Ермишкиным в группе Б.Н. Вепринцева в ИБФ АН СССР.

В 60-70-е годы техника электрофизиологического эксперимента была такова, что работать на нейронах позвоночных (диаметр 10-50 мкм) было невозможно. Основополагающие работы были сделаны на гигантском аксоне кальмара (Hodgkin, Huxly, Katz, Keynes) или на гигантских нейронах аплизии Aplysia californica и Helix asersa (Arvanitaki, Chalazonitis, Tauc, Gerschenfeld). Ни кальмары, ни аплизии не были доступны нам. Была предпринята попытка работать на нейронах другого голожаберного моллюска Tritonia diomedia, обитающего в Японском море; несколько лет предпринимались экспедиции (очень дорогие) на остров Путятин. Но добывать глубоководного моллюска и хранить мозг хотя бы сутки оказалось очень проблематично. Повезло! Оказалось, что у пресноводных брюхоногих моллюсков большого прудовика (Lymnaea stagnalis) и катушки роговой (Planorbarius corneus) нейроны мельче, но некоторые достигают 200 мкм в диаметре. Натолкнул на это «открытие» ученик академика Х.С. Коштоянца, опытный физиолог Дмитрий Антонович Сахаров, разговаривая в трамвае с Б.Н. Вепринцевым. Вся группа перешла на этот замечательный объект. Казалось, что можно применять самые разные методы: регистрировать и изучать ответы на электрические и химические стимулы, следить за синтезом нуклеиновых кислот и изменениями морфологии, использовать мозг и нейроны для культивирования и получения нейронных сетей – и все это на ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ ГИГАНТСКИХ нейронах. Моллюсков по осени заготовляли сами, совершая поездки (очень увлекательные) на озера-старицы в пойме Оки. Отлавливали ТЫСЯЧАМИ (сейчас стыдно вспоминать!!!) и хранили в холодной комнате в ваннах всю зиму. В настоящее время это и не нужно (перешли на другие объекты) и невозможно: популяция моллюсков сильно убавилась из-за загрязнений, попадавших систематически с пойменных полей. Возможно, что и хищнический отлов сыграл роль.

В начале 60-х годов научное сообщество было взбудоражено работами шведского нейрофизиолога Хидена (Hyden), обнаружившего, что при возбуждении в нейронах увеличивается содержание нуклеиновых кислот. Было высказано предположение, что это явление лежит в основе сохранения памятного следа. Вдохновленный этой идеей Б.Н. Вепринцев предложил (1962 г.!) в качестве темы диссертации Е.А. Вульфиус «Прижизненное измерение количества ДНК и РНК в нейронах при генерации ими потенциалов действия (название примерное)». Предполагалось, что будут получены переживавшие в условиях культуры нейроны Пуркинье из мозжечка кролика. Работа включала множество экспериментальных процедур от мытья и стерилизации посуды, подготовки среды до операции, забора материала, ведения культуры в специально разработанной плоской камере с кварцевыми «дном» и «крышей», раздражение нейронов и отведения потенциалов и сканирования одних и тех же нейронов до и после возбуждения в цейтраферном УФ микроскопе. Е.А. Вульфиус была абсолютно не готова к выполнению такой задачи и ничего не смогла сделать. Только через несколько лет стало ясно, что задача могла быть выполнена как минимум тремя исследователями, владеющими необходимыми методами. Направление было продолжено С.И. Розановым, Т.Л. Дьяконовой и Э.Н. Гаховой. Розанов использовал два препарата: кольцо изолированных ганглиев прудовика Lymnaea stagnalis вместе с отходящими от ганглиев нервами и обезглавленного таракана. Была создана установка для одновременного отведения электрической активности от нескольких нервов и тел нейронов. Обнаружили, что в 35% случаев сочетанное раздражение пары нервов приводит к устойчивым изменениям «спонтанной» активности системы, что было расценено как результат структурных изменений межнейронных связей. У таракана вырабатывали условный рефлекс отдергивания ноги при раздражении током и определяли влияние температуры и электрошока на сохранение рефлекса, выделили две фазы с разной зависимостью, которые, по-видимому, отражали кратковременную и долговременную память (С.И. Розанов «Влияние раздражения на формирование межнейронных связей в препаратах нервной системы беспозвоночных», канд. дисс., 1969 г.).

Дьяконова Т.Л. также использовала два препарата: нервную брюшную цепочку дождевого червя (электрическое раздражение целой цепочки или механическое раздражение червя) и идентифицированные гигантские нейроны L. stagnalis и T. diomedia (раздражение через нервы) с последующим определением количества РНК в нейронах и глиальных клетках методами цитофотометрии и гистохимии. Оказалось, что при стимуляции электрической активности содержание РНК в цитоплазме нейронов увеличивалось, но не за счет синтеза новой РНК, а в результате транспорта из ядра в цитоплазму и из глиальных клеток в нейрон; об этом говорили ультраструктурные морфологические изменения и низкая температурная зависимость. В то же время было обнаружено усиление включения метки в РНК окружающей глии. Усиление синтеза РНК в нейронах было обнаружено в период, следующий за активным состоянием (Т.Л. Дьяконова «Исследование метаболизма РНК и изменений в ультраструктуре и цитофотоморфологии нейрона при генерации им потенциалов действия», канд. дисс., 1970 г.). сс., 1970 г.).

Гахова Э.Н. исследовала зависимость включения метки 3Н-уридина в РНК гигантских идентифицированных нейронов и глиальных клеток трех видов моллюсков при изменении наружной концентрации К+ и при обработке адреналином. При этом оказалось, что значительная часть потенциала покоя (ПП) нейронов обусловлена не неравномерным распределением ионов К+, а вкладом электрогенного Na+,K+-насоса. При повышении наружной концентрации К+ или инкубации ганглионарного кольца с адреналином концентрация РНК в цитоплазме нейронов снижалась, а в глии – росла, после удаления адреналина уровень РНК в нейронах повышался. Результаты интерпретировали как зависимость синтеза нуклеиновых кислот от уровня АТФ в нервной клетке, при повышенном расходе АТФ на восстановление ионного гомеостаза заторможен синтез макромолекул. Результаты были изложены Э.Н. Гаховой в кандидатской диссертации«Трансмембранные ионные потоки – возможные регуляторы синтеза РНК в нейронах» (1979 г.).

Круг работ по синтезу РНК был суммирован в докторской диссертации Б.Н. Вепринцева «О связи электрической активности нервной клетки с синтезом в ней РНК и роли клеточной мембраны в регулировании биосинтеза РНК в клетке» (1971 г.).

Вепринцеву Б.Н. очень хотелось, чтобы исследование связи между электрической активностью нейронов и синтезом в них макромолекул было сделано на одних и тех же клетках с «серьезной электрофизиологией», на нейронных сетях, где бы можно проследить структурные изменения, вызванные передачей сигнала с одного нейрона на другой. Для осуществления этой мечты была собрана хорошая группа электрофизиологов (А.Н. Кислов, О.М. Жерелова, И.В. Крастс, Н.К. Чемерис,) и группа культуры нервной ткани (М.А. Костенко, В.И. Гелетюк, потом аспиранты, В.С. Мусиенко, Т.И. Смолихина). Не удалось. Электрофизиологи занимались тем, чем хотели: изучением механизма генерации потенциалов действия в соме нейронов прудовика. На этом направлении получены очень существенные результаты. Ольга Жерелова и Игорь Крастс, работая в паре, обнаружили, что большой вклад в генерацию потенциала действия (ПД) вносит увеличение кальциевой проводимости (до этого считалось a priori, что в соме нейрона, как и в аксоне кальмара, ПД генерируется за счет потока Na+). Почти одновременно кальциевый механизм ПД показали для нейронов другого брюхоногого моллюска Helix pomatia в лаборатории академика АН СССР П.Г. Костюка (Институт физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР, Киев). После неизбежных дебатов «кто первый» О.М. Жерелова и И.В. Крастс были включены соавторами в зарегистрированное «Открытие явления избирательной регуляции кальциевой проводимости мембраны сомы нервных клеток» (1983 г.). Кроме того, Игорь Крастс проверил, проницаем ли потенциал-активируемый Са2+ канал для Mg2+ (И.В. Крастс. «Электрические характеристики гигантских нейронов моллюсков и роль ионов натрия, кальция и магния в генерации потенциала действия», канд. дисс., 1972 г.).

В 60-80-е годы ситуация с техникой была очень печальной. Из необходимого оборудования отечественная промышленность производила только световые микроскопы и осциллографы. Нужны были усилители и микроманипуляторы. За границей тоже не выпускали серийно электрофизиологическую технику, да и денег на покупку неоткуда было взять. Лаборатория (да и не только наша, фактически все электрофизиологи Советского Союза) работала на самоделках, благо среди сотрудников были такие рукастые и головастые люди, как А.Н. Кислов, Н.К. Чемерис, И.В. Крастс. А в соседнем здании размещалось Специальное Конструкторское бюро биологического приборостроения (СКБ БП АН СССР). Заслуга Б.Н. Вепринцева в том, что он сумел заинтересовать руководство и разработчиков СКБ, возникла совместная группа по созданию комплекса приборов для электрофизиологических исследований. Это был настоящий прорыв в технике экспериментов. Благодаря тому, что наши сотрудники составили техзадание и курировали разработку, лаборатория получала и испытывала макетные экземпляры всех так необходимых узлов. В результате этой работы удалось выйти на серийный выпуск аппаратуры для клеточных исследований. Коллектив разработчиков: Вепринцев Б.Н. (руководитель), Чемерис Н.К., Крастс И.В. (ИБФ АН СССР); Хохлов А.М., Иванов Е.Г., Решетников В.И. (СКБ БП РАН); Кононов Б.С., Шведов В.М. (Экспериментальный завод научного приборостроения, Черноголовка) в 1982 г.получили Государственную премию в области науки и техники за «Разработку, создание и внедрение комплекса прецизионных приборов для микрохирургии и измерения электрических характеристик живой клетки».

А.Н. Кислову было предложено проверить, есть ли потенциал на ядерной мембране нейронов прудовика; тему спровоцировала сенсационная статья Loewenstein W.R., Kanno Y. «Some electrical properties of a nuclear membrane examined with a microelecrtrode», J. Gen. Physiol., 1963, 46:1123-1140. Авторы заявили о существовании потенциала ядерной мембраны в клетках слюнной железы дрозофилы.

А.Н. Кислов - золотые руки - проверил: нет, это артефакт, «по дороге» к ядру кончик электрода забивается, в результате изменяется собственный электродный потенциал. По-видимому, и в слюнной железе было то же самое, по крайней мере, никаких работ на эту тему больше не появилось. Отрицательный результат - тоже важный результат, однако, Кислов, сделав красивую работу, защищать диссертацию на эту тему не стал, а перешел на далекую тему (см. ниже).

Марина Костенко и Виталий Гелетюк исследовали характеристики нейронов прудовика в условиях культуры целого мозга моллюска, фрагментов ганглиев и изолированных нейронов. Ими были подобраны оптимальные среды, температурный режим и способ культивирования для обеспечения длительного (до нескольких месяцев) сохранения электрофизиологических характеристик, морфологии, чувствительности к нейротрансмиттерам и синтеза РНК, близких к свойствам интактных нейронов в ганглиях. В 1973 г. были защищены кандидатские диссертации: М.А. Костенко «Цитофизиологические характеристики изолированных нейронов моллюска Limnaea stagnalis и культивирование их in vitro» и В.И. Гелетюк «Электрические и морфологические характеристики нейронов изолированного мозга моллюска Limnaea stagnalis в условиях культуры ткани». Неоценимый вклад сделала Марина Костенко, нащупавшая и разработавшая вместе с Виталием Гелетюком, способ изолирования нейронов из ганглиев без нарушения их жизнеспособности. Результаты этой работы, имевшей целью культивирование одиночных нейронов, оказались, прежде всего, очень полезными для электрофизиологических исследований. Для применения этой техники в электрофизиологии много сделали А.Н. Кислов и В.И. Гелетюк. Стало возможным регистрировать ответы на все воздействия именно конкретного нейрона, без вклада ответов, опосредованных через связи с другими нервными элементами, сильно ускорилась диффузия всех веществ, добавляемых в наружный раствор. Это было тем более важно, что в начале 70-х годов ученые еще не умели изолировать нейроны ни беспозвоночных, ни позвоночных животных. Очень быстро все электрофизиологи лаборатории перешли на изолированный нейрон в качестве объекта исследования. Следует также отметить, что простой способ получения изолированного нейрона моллюска стал основой разработки в лаборатории академика П.Г. Костюка (Институт физиологии им. А.А. Богомольца, АН УССР) метода так называемого «диализованного» или перфузированного нейрона; метод дал возможность изменять состав внутренней среды нейрона.

Изучение влияния состава культуральной среды и наличия глии на выживаемость нейронов и рост отростков было продолжено под руководством М.А. Костенко аспиранткой Н.Н. Третьяк и соискателями Т.И. Смолихиной и В.С .Мусиенко. Они выявили роль ионного гомеостаза (потенцирующее действие повышенной концентрации натрия и ингибирующее действие калия и кальция на рост отростков, влияние внутриклеточного кислотно-щелочного баланса), предположительное влияние глии через ионный гомеостаз (а не за счет трофической функции) и отсутствие прямой зависимости между синтезом РНК и белка и ростом отростков (Т.И. Смолихина «Роль ионов в индукции роста отростков и регуляции синтеза белка в дифференцированных нейронах в культуре», канд. дисс., 1979 г.; Н.Н. Третьяк «Факторы среды, определяющие выживаемость и регенерацию нейронов моллюсков в культуре», канд. дисс., 1982 г.; В.С. Мусиенко «Экспериментальная регуляция роста отростков нейронов моллюска в культуре», канд. дисс., 1982 г.).

Весной 1965 г. в командировку для освоения метода регистрации потенциала приехала из Ленинграда (Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова АН СССР) Элла Владиславовна Зеймаль, сотрудница профессора М.Я. Михельсона, с которым Б.Н. Вепринцев познакомился на о. Путятин. Вепринцев и Михельсон очень друг другу понравились, и первый убедил второго, что оценивать возбуждение холинорецепторов (ХР) следует не по сокращению мышцы (эффект, удаленный от первичной реакции), а по изменению потенциала мембраны. Поскольку к этому времени единственной работающей установкой была установка Екатерины Вульфиус, то ей и выпало «учить» Э.В. Зеймаль. И так само собой вышло, что недели через три (за месяц до окончания аспирантского срока Е.В.) они обнаружили ХР в нейронах прудовика и катушки, работа пошла в направлении их исследования, а связь электрической активности с синтезом нуклеиновых кислот оставлена, несмотря на протесты Вепринцева. Таким образом, в лаборатории возникло новое направление, сохранившееся по сей день.

Для начала была подробно исследована чувствительность гигантских нейронов L.stagnalis и P.corneus к так называемым холиномиметикам (агонистам) и холинолитикам (антагонистам) ХР, по-разному активных на трех типах ХР позвоночных. Обнаружено, что в одних гигантских идентифицированных нейронах есть как ХР никотинового, так и мускаринового типа, в других – только никотинового (нХР), причем эти нХР проявляют сходство фармакологического профиля с нХР скелетных мышц (а не вегетативных ганглиев). Кроме того была попытка охарактеризовать «взаимное расположение нХР» на мембране нейронов в соответствии с очень красивой, но впоследствии оказавшейся ошибочной, гипотезой М.Я. Михельсона - Н.В. Хромова-Борисова. По этой работе и была опубликована первая статья в Nature (1967 г.). Первый этап работ в этом направлении завершился к 1972 г. в виде кандидатских диссертаций: Е.А. Вульфиус «Холинорецепторы нейронов некоторых брюхоногих моллюсков» (1968 г.), целевого аспиранта Т.В. Гоголадзе «Особенности структуры холинорецепторов нейронов брюхоногого моллюска Planorbarius corneus» (1972 г.). Вслед за этим аспирант П.Д. Брежестовский исследовал влияние температуры на кинетику ответов нейронов моллюсков и концевой пластинки мышцы лягушки на ацетилхолин и другие агонисты.

Лаборатория клеточной нейробиологии ИБК РАН ® 2017    Яндекс.Метрика